非洲猪瘟病毒细胞传代致弱株研究进展

摘要：目前非洲猪瘟（African swine fever,ASF）仍无疫苗可用，使得该病防控难度较高。早期非洲猪瘟病毒（ASFV）的弱毒株研制主要通过细胞传代方式。经过国外多年研究积累，现已经在多种细胞上获得毒力致弱毒株。细胞传代致弱株是ASF疫苗研究的候选方向之一，且对于基因敲除弱毒疫苗研究具有很好的指导借鉴作用。国内目前尚无这方面的调查研究，为此对国际上ASFV细胞传代致弱毒株相关研究进行整理，分析其传代致弱规律，以期为我国ASFV细胞适应株研究及新型疫苗研制提供参考。

自1921年报道以后，在很长一段时间里非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）一直在非洲流行，并没有引起大多数国家，特别是主要猪肉生产国的重视，直到1957年ASFV传入葡萄牙、1960年传入西班牙后才引起国际广泛关注。1957年，葡萄牙因ASFV传入导致损失17 000头猪后才开始研究ASFV，发现ASFV感染的红细胞吸附现象和ASFV可以在细胞上繁殖传代。早期研究就已发现，分离强毒株在细胞上连续传代后再次接种猪不再出现典型的临床症状，而且这些猪可以经受住同源强毒株的攻击。但后期的一些研究却发现，某些毒株在传代细胞系连续传代后虽然毒力减弱，却不能提供同源保护。同时，不同ASFV在不同细胞上的适应性传代结果并不相同。面对上述进展，国内尚无专业材料进行论述，因此本文将对国际上ASFV细胞传代致弱毒株相关研究进行整理，分析其传代致弱规律，从而为我国ASFV细胞适应株研究及新型疫苗研制提供参考。

1 细胞传代致弱株研究历程

自1957年ASFV传入葡萄牙后，就在西欧逐步扩散蔓延并传至南美洲。因流行毒株只有基因I型，早期研究主要使用基因I型毒株进行细胞适应研究，代表适应株如L'60BM89、BA71v、E75CV1等。ASFV细胞适应株研究最早开始于20世纪60年代，首先研究的母本毒株主要有Lisbon 60毒株（1960年分离自葡萄牙里斯本发病家猪）、葡萄牙分离株1455(1961年分离自葡萄牙）和Hinde毒株（分离自肯尼亚）。1961年，Ribeiro等将Lisbon 60毒株在骨髓细胞传代89代后（L'60BM89），又在Vero细胞上继续传代15代，证明ASFV可在传代细胞系繁殖。1963年，Ribeiro等又将葡萄牙1455毒株在骨髓细胞上连续传代并发现其毒力逐渐致弱。葡萄牙1455毒株传代至40代后接种动物仍可导致典型的临床症状，当传代至70代时，临床症状大大减轻并能抵御强毒株攻击。

1962年，Malmquist等将Hinde毒株（分离自肯尼亚）在猪肾细胞（PK-2a）上传代，当传至75代或更高代次后（90、103和104代），发现传代毒株接种猪完全存活；使用90代毒株免疫猪后再使用亲本强毒株接种（105 TCID50），发现接种猪均死亡，但先使用103代毒株免疫再使用50代毒株免疫的接种猪能抵御亲本强毒株攻击，证明细胞传代致弱毒株可以产生部分保护力。1963年Botija将5株西班牙分离株在PK-2a细胞和白细胞上连续传代，也发现毒力减弱，其中一株毒株在传至60代以后对猪无任何致病力。1965年Hess等也利用PK-2a细胞传代致弱多株ASFV,1974年利用幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells,BHK21）传代致弱Tengani毒株。

1967年，Bannister等使用葡萄牙疫苗候选株进行动物试验。该毒株以Lisbon 60毒株为母本，在猪骨髓细胞上继续传至81代所得。疫苗株接种1头猪后（114号），将第3天体温反应最大时采集的肝素抗凝血肌肉注射另外4头健康猪（115、116、117和118号），结果未出现体温升高和临床反应。接种后第71天，4头猪饲喂含有葡萄牙强毒株的血液和组织，进行口腔感染试验（第1次攻毒），4头猪均未出现体温升高和临床反应。为进一步验证疫苗效果，对其中的2头猪（115和117号）在第87天时（饲喂强毒后第16天），进行第二次攻毒试验（肌肉注射3 m L强毒血液），结果115和117号猪初期均未出现体温升高和临床反应，但115号猪在第108天后（第2次攻毒后第22天）开始出现4轮温度上下波动随后逐渐升温，直至按计划扑杀时达到最高温度（41.3℃）。同年，Greig等[13]对Spencer株（1951年分离自南非约翰内斯堡）、Portuguese challenge株（分离自葡萄牙）、Gasson株（1950年分离自肯尼亚）进行细胞连续传代并使用亲本毒株攻毒验证，结果发现Spencer株传至35代后，接种猪无临床症状且能保护接种猪免受亲本毒株攻击；Portuguese challenge株传至34代后，接种猪出现体温小幅波动且能为接种猪提供针对亲本毒株的保护；Gasson株传至23代后，接种猪毒力减弱但不能保护接种猪免受亲本毒株攻击（接种2头猪，其中1头死亡，1头升温后恢复正常但未能抵抗亲本毒株攻击）。

1968年，Stone等利用致弱的Lisbon 60毒株肌肉注射免疫22头猪（接种剂量每头105TCID50/m L）并于免疫后第117天进行同源毒株攻毒试验（使用Lisbon 60攻毒发病猪脾脏匀浆液，稀释至104 LD50）。所有免疫猪健康存活，但随后攻毒的18头猪中有17头猪出现体温反应，其中4头死亡；攻毒后第23天扑杀存活的14只猪，制备肺脏和脾脏混合匀浆液并继续接种2头健康非免疫猪，结果2头猪均死亡。同年，Coggins等将肯尼亚强毒株（Hinde WH II virus)和乌干达强毒株（Uganda ASF virus)[16]在细胞上连续稀释传代，发现部分毒株的红细胞吸附功能丢失，但继续更换到猪体内传代，可能会重新获得红细胞吸附功能。无红细胞吸附功能的毒株毒力减弱，接种猪后大部分猪存活并能抵御强毒株攻击。

从1976年开始，有研究人员将BA71株（1971年分离自西班牙巴达霍斯省一发病猪脾脏，已在猪骨髓细胞传代36代）在Vero细胞上适应传代100代，最终获得无致病力的Vero细胞适应株（BA71v)。1979年，Thomson等使用致弱的CV毒株（1962年分离自南非，在细胞上连续传44代致弱）接种2头猪，发现使用强毒株攻毒后不能产生足够的保护力。俄罗斯国家兽医病毒学和微生物学研究所（National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology,VNIIVVi M）也制备了多株细胞传代致弱株，如刚果KK-262株（将刚果1949年分离株在猪肾细胞传至50代后再在猪骨髓细胞传262代）和法国FK-32/135株（将法国1964年分离株在猪骨髓细胞上传135代）等。但上述毒株未进行免疫接种及攻毒保护试验。

1981年，Ruiz-Gonzalvo等将E75强毒株（1975年分离自西班牙）在猴肾成纤维细胞（CV1）上连续传4代，获得E75CV1毒株（也称258-CV1-4），将其接种25头家猪后发现有20头猪存活，且能部分抵御同源强毒株的攻击。后期研究使用类似策略对E70强毒株（1970年分离自西班牙）进行了更多代次传代，如MS14和MS44（在猴肾细胞分别传14代和44代），但其主要目的是将该毒株用于基因组比对分析或作为代表毒株进行毒力基因研究。2015年对E75CV1进行更深入研究时发现，该毒株以105和102 HAU50剂量肌肉注射接种家猪出现部分死亡，以104 HAU50接种却能全部存活且能抵御同源毒株攻击。

2007年ASFV传入格鲁吉亚并相继传入俄罗斯、罗马尼亚、德国等东欧、中欧国家后，该病毒研究方向开始向基因II型毒株倾斜。2015年，Krug等将格鲁吉亚毒株（ASFV-G)Vero细胞适应株第30代、60代、80代和110代传代毒株进行全基因序列分析和攻毒保护试验，结果发现Vero细胞适应株全基因组序列在左臂和右臂特定位置发生了渐进性丢失，各代次毒株以104 HAD50剂量接种易感猪后，第110代毒已无任何临床反应，但攻毒后无法提供有效保护。

2015年Balysheva等将Stavropol 01/08强毒株在猪肾胚胎细胞系与猪淋巴细胞混合细胞系上（the hybrid cell line SPEV TK with pig lymphocytes,A4C2）传14代、24代和33代，在CV细胞和猪肾细胞（PSGK-60）上分别传20代，结果发现A4C2/9k细胞的14代毒和PSGK-60细胞的20代毒均表现强毒特性，接种猪全部死亡。A4C2/9k细胞的24代、33代毒和CV细胞的20代毒毒力减弱，接毒猪全部存活，但无法保护猪免于强毒株攻击。

2020年，俄罗斯联邦病毒学和微生物学研究中心（原全俄兽医病毒学与微生物学研究所）Alexey等将其实验室研制的弱毒株按照血清群分类进行了详细比对分析。这些弱毒株绝大多数通过细胞传代致弱（主要是猪骨髓细胞），如血清I型的LK-111株、Katanga-350株，血清II型的KK-202株，血清III型的MK-200株，血清IV型的FK-32/135株，血清V型的TSP-80/300株，血清VI型的TS-7/230株，血清VII型的UK-50株和血清VIII型的RK-30株。这些毒株均已致弱并可对强毒株攻击提供不同水平的免疫保护。

ASFV细胞传代致弱株是疫苗研究历史中的重要组成部分，也是未来有望推向市场的候选方向之一。如欧盟正在主导实施疫苗研制计划（Vacdiva project），将俄罗斯研制的传代细胞适应弱毒株（Arriah CV-1株）作为未来重点研究的3个疫苗候选株之一。此外，经过大量比对试验验证，俄罗斯联邦病毒学和微生物学研究中心挑选出的FK-32/135株也具有较好的研究潜质，但仍需对其接种途径进一步研究探索（模拟自然感染途径）。

2 细胞传代致弱株研究意义

在ASFV传播的100年中，很多国家曾经借助严格的生物安全防控措施成功净化了ASFV。但是ASFV具有致死率高，低温环境抵抗力强，可借助冷冻猪肉制品、泔水和软蜱传播等特点，使得该病的疫苗使用需求高于其他疫病。2017年，欧盟发布ASFV疫苗可行性发展线路图，仍将研制ASFV疫苗放到了控制和根除ASFV的重要位置。早期ASFV弱毒株研制主要通过细胞传代方式致弱，如BA71v,E75CV1等。但增加传代次数会导致ASFV毒力降低，难以提供对亲本毒株的攻毒保护，因而很难找到合适的传代次数进行后续动物试验，具有一定的盲目性和随机性，更无法预判攻毒保护效果。因此，相较于减毒疫苗株制备，细胞传代致弱株/适应株在其他方向，如滴度测定方法建立、基因组功能研究和致病机理研究等方向发挥的作用可能更大。特别在全基因组比对分析研究中，通过细胞传代致弱株丢失基因的区域分析，对于基因敲除弱毒疫苗研究具有很好的指导借鉴作用。如，格鲁吉亚株（ASFV-G）在Vero细胞上连续传至60代后，其I177L基因编码氨基酸序列发生了1个点突变（第42位由脯氨酸变为丝氨酸），这可能为后期I177L基因缺失株研制提供了一定线索。同时，20世纪60年代在西班牙和葡萄牙大范围使用弱毒疫苗（在猪骨髓细胞上连续传代所得）导致的“免疫失败事件”，使得科学家认识到接种猪本身的免疫机能状态会影响弱毒苗效果。如，无红细胞吸附活性的Kc-160株，以107.5 TCID50的剂量接种健康家猪，会有75%～80%的猪出现轻微或中等临床反应，但接种免疫机能降低的猪会发生20%的死亡。

因ASFV一般不适应在传代细胞系中繁殖，所以传统的细胞传代致弱株在传代细胞系连续传代之前都需要进行一定的驯化，这也在一定程度上限制了弱毒疫苗株进行产业化大规模生产。但近期有多篇报道称找到了支持ASFV高效复制的传代细胞系，如A4C2/9K、WSL（野猪肺细胞）、MA104（猴肾细胞）、ZMAC-4（胎猪肺巨噬细胞）和IPKM（猪肾巨噬细胞）等。这些细胞系都在一定程度上满足了ASFV连续传代的科研目的，但连续传代后是否像其他细胞系一样发生基因丢失或免疫原性改变等，仍需大量试验验证和探讨。