狂犬病的流行特点及其动物疫苗研究进展
摘要： 狂犬病又称恐水症，是由狂犬病病毒引起的一种烈性人畜共患病，该病感染范围广泛，人和各种温血哺乳动物均易感染。如果临床上出现神经症状，几乎100%死亡，而最为有效预防狂犬病方法首选接种狂犬病疫苗。为了有效控制狂犬病的发生和传播，本文将对当前狂犬病的流行特点及其动物狂犬病疫苗研究进展等方面做一综述，为该病的有效防控提供参考。
由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一种急性传染病称为狂犬病，以恐水、狂躁不安、怕风、神经性抽搐为主要临床特征。据世卫组织最新数据表明，全球每年约有5.9万人死亡于狂犬病，其中95%的病例来自非洲、亚洲等发展中国家。我国也将该病列为二类动物疫病。研究表明中国狂犬病的传染源有可能来自野生动物，自上世纪90年代以来，我国已有100多人死于与野生动物相关的狂犬病，该病毒已传染给其他野生动物和家畜,这给我国实现“2030年全球消除犬传染人狂犬病计划”带来具有的挑战。因此，人类狂犬病的消除主要取决于对动物狂犬病的控制。而了解动物狂犬病的流行特点及其疫苗研究进展，对狂犬病的科学防控具有一定的参考意义。
1 病原学特点及理化性质
RABV属于弹状病毒科，狂犬病病毒属，病毒粒子的外形呈弹状，直径约75nm，外层有囊膜包裹的RNA病毒。RABV主要由5种结构蛋白组成，包括镶嵌在内的基因组RNA核蛋白（N）、转录大蛋白（L）、基质蛋白（M）磷蛋白（P）以及糖蛋白（G）。
RABV对紫外线、光照、高温、干燥较为敏感，RABV在高温中加热一段时间就会死亡。该病毒还对肥皂水、强酸或弱酸、强碱、甲醛、去污剂、碘等试剂敏感。在低温环境下，5-6周后，RABV的毒性丧失，但RABV感染组织后，将其-20℃保存于含有50%甘油中，可存活数年且仍具有感染性。
2 狂犬病的流行特点
2.1 全球狂犬病分布和流行趋势
亚洲和非洲是狂犬病的高发区域，其中由狂犬病导致死亡人数最多国家是印度[7]，其传染源主要是犬，印度的流浪犬数量较多，管理难度大，每年大约有2万人死于犬咬伤所致的狂犬病。非洲地区，由于经济相对落后，医疗设备及药品物资匮乏，并且当地人们只对疟疾、艾滋病较为重视，而对狂犬病的关注较少，从而导致的狂犬病发病率不断上升，病例数高达1.5万例。在亚洲其他地区，野生动物也可引起狂犬病的传播，尤其是狐狸和狼。
美洲地区对狂犬病预防及其重视，虽然人感染狂犬病的病例逐年下降，但动物间的狂犬病流行情况却十分严峻，有研究表明，近年来从蝙蝠中检测到狂犬病病毒的载量不断上升，情况不容乐观。
近几年，欧洲地区的狂犬病发病率则呈下降趋势，其中，人感染狂犬病的病例中大部分野生动物相关，研究发现患病动物中60%以上是野生动物，其中红狐的发病率较高。
2.2 我国狂犬病流行趋势和病例分布
我国是受狂犬病危害较为严重的国家之一，根据国家疾病预防控制局数据统计，如图1所示，我国狂犬病发病数和死亡人数呈下降趋势，其中我国狂犬病的病死人数由2010年的2014例下降到2020年的188例，其主要原因是我国加强对暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)管理和公众对PEP的认识。这十年间，人感染狂犬病的病例数虽然下降，而感染范围却在国内不断扩大，在过去无狂犬病病例和低发病率的省份，如宁夏回族自治区、青海、甘肃、北京、吉林和西藏等地也相继出现了新增病例，如图3所示。
据不完全统计，我国大约有8,000万只狗，犬的疫苗接种从农村到城市各不相同，免疫覆盖率也参差不齐，有研究称，我国95%以上的狂犬病病例具有犬咬伤史。自上世纪90年代以来，野生动物如雪貂、獾已在江西、浙江和安徽等省份造成至少87人死亡，其原因是中国东南部的雪貂、獾携带来源于狗的RABV，并在雪貂、獾等群体中水平传播。而我国黑龙江、新疆等北部地区的狂犬病病例则是由狐狸和貉造成病毒传播的。同时野生动物将狂犬病毒传染给其他经济动物，造成巨大经济损失，在受感染的经济动物中，如牛和骆驼，有可能出现狂犬病症状，将会给兽医和养殖户带来潜在的狂犬病风险。此外，研究发现，我国从狐狸和貉中分离的RABV与来自蒙古或其他邻国的接触的动物分离株的同源性相似，表明RABV可能存在跨境传播的风险。因此，定期监测中国与周边国家之间的狂犬病跨境传播对野生动物感染狂犬病的控制具有重要意义。
3 病毒检测方法
3.1 病毒分离和培养
采集患病动物死后的新鲜脑组织，将组织液注射到乳鼠体内或接种细胞组织中进行培养并扩增，利用免疫荧光技术对病毒颗粒进行检测。该方法适用于对疑似感染的病死动物进行确诊。
3.2 荧光抗体技术
荧光抗体技术(FAT)指脑组织切片用丙酮固定液将其固定后，利用抗原抗体相结合特异性，经荧光抗体染色后，通过荧光显微镜观察脑组织切片样品是否含有病毒颗粒或者病毒包涵体从而进行判断。该方法因操作步骤简单、方便且成本低，被世界动物卫生组织（OIE）所推荐，也是实验室中常用的检测方法之一。
3.3 直接荧光抗体技术
直接荧光抗体技术（DFA）是狂犬病实验室诊断的“金标准”,该技术被世界动物卫生组织（OIE）所认证。该方法是将疑似患病动物的脑组织切片进行固定后，与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的RABV单克隆抗体发生特异性结合，通过荧光显微镜可直接观察病毒颗粒进行判断。该方法快速、特异性好且灵敏，是实验室确诊狂犬病的首选方法。
3.4 快速免疫组化技术
快速免疫组化技术（dRIT）主要用于狂犬病的定性检测。该方法主要采集疑似患病动物的脑组织样品，与特异性RABV单克隆抗体发生特异性的结合后，经过染色后，可直接在光学显微镜下观察是否存在病毒颗粒，从而判断是否感染狂犬病。该方法的特异性和灵敏性与DFA相当，并且所用的仪器没有DFA所用的荧光显微镜昂贵，被大多数国家推广使用。
3.5 酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（ELISA）利用抗原抗体特异性结合原理，将RABV特异性单克隆抗体加入到平板上，加入待检样品与其发生特异性结合后，再加入的辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记物与RABV单克隆抗体进行特异性结合产生显色反应，通过观察显色反应程度判断病原阴阳性。该方法虽然操作简单方便、检测速度快，但敏感性较差，有假阳性或假阴性的情况。
3.6 核酸检测技术
核酸检测RABV通常采用RT-PCR技术，根据RABV的保守序列，利用软件设计特异性的引物，以待检样品为模板，扩增出目的基因片段，根据扩增结果进行判断。快速灵敏的特点适用于大批量样品初筛，但结果时常会受非特异性序列变异、样品采集时间、样品类型、实验环境及实验人员等因素影响，容易造成假阳性或假阴性，因此PCR技术的操作需经过严格培训，保证操作的规范性，避免污染造成结果误差。
4 动物狂犬病疫苗的研究现状
动物狂犬病疫苗经过多年的研究，从神经组织疫苗到现在的基因重组疫苗发生了质的飞跃，疫苗免疫原性增强的同时，免疫副作用也不断减少，目前成为产品的的狂犬病疫苗株通常有CTN-1、aG、PM、SAD、ERA和Flury等。
4.1 神经组织疫苗
神经组织疫苗是利用石炭酸或石炭酸和乙醚的混合物将感染狂犬病毒的羊脑组织进行灭活后制成的，巴斯德在1988年，对50多只犬进行免疫试验，具有较好的保护率。但由于免疫后引起严重的不良反应，目前该疫苗已经停止生产。
4.2 鸡胚疫苗
鸡胚疫苗是利用鸡胚接种RABV后，经多次传代，RABV毒力削弱，使其失去致病性。该方法常用的毒株有Flury和Kelev。虽然该疫苗毒力已经减弱，但是仍然存在一定的感染风险，因此在临床上并不推广使用。
4.3 细胞培养疫苗
细胞培养疫苗是指将狂犬病病毒接种到BHK-21、MDCK和Vero细胞中进行传代培养，将收集到的病毒液可制备成灭活疫苗或弱毒疫苗。灭活疫苗通常用β-丙内酯进行灭活，将狂犬病病毒的核酸破坏，不具有毒性，并且还保留了病毒的免疫原性，刺激机体产生抗体。弱毒疫苗主要选用Flury株和ERA株，前者用于犬类动物免疫；后者用于草食性动物免疫。
4.4 基因工程疫苗
基因工程苗是利用基因重组技术或反向遗传技术，将含有RABV的抗原性基因插入到目标载体而制备的疫苗，包括灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等。研究人员将表达RABV的抗原性蛋白G的重组RABV灭活疫苗对小鼠进行注射免疫，试验结果显示小鼠产生较高的抗体水平；此外，研究表明,还可通过免疫激活因子提高疫苗免疫原性，研究人员将B细胞激活因子(BAFF)插入到狂犬病病毒 (RABV) 颗粒的膜上后免疫小鼠，结果显示，小鼠体内迅速产生较高的特异性抗体。
4.5 口服疫苗
口服疫苗可分为弱毒口服疫苗和基因工程重组口服疫苗。20世纪70年代，美国开展对野生动物狐狸进行投喂狂犬病口服弱毒疫苗的免疫效果监测试验，结果表明，ERA株通过口服免疫，能刺激机体产生较高的抗体。重组基因工程口服疫苗是利用基因重组技术，将RABV免疫原性基因插入到表达载体中进行表达，将得到重组载体制成疫苗直接投放至野外环境中，以口服的方式免疫野生动物，结果表明具备较好的免疫原性，其中常用的表达载体包括痘病毒、腺病毒或植物病毒等。此外，佐剂也有助于增强病毒疫苗的免疫反应，相关研究表明，青蒿素衍生物青蒿琥酯能增强小鼠狂犬病毒灭活的免疫原性，青蒿琥酯将来可用作狂犬病疫苗接种的新候选佐剂，增强狂犬病疫苗免疫原性。
5 小结
至今为止，全球仍有大约150个国家和地区流行狂犬病。我国由犬咬伤发生狂犬病的病例有所减少，但由于蝙蝠、狐狸等野生动物体内依然携带RABV，野生动物咬伤引起的狂犬病例数正在增加，这对我国实现“2030年全面消除人间狂犬病”计划带来严峻挑战。因此，我们不仅仅要加强人们暴露后的疫苗接种，对于动物而言，尤其是野生动物，应加强动物狂犬病疫苗的免疫，因野生动物免疫难度大，开发新型廉价、安全和有效的口服疫苗迫在眉睫。因此，对狂犬病进行流行病学的调查、诊断及免疫接种是控制和预防狂犬病流行的有效综合防控措施。
