非洲猪瘟病毒检测方法研究进展
摘要：本文对非洲猪瘟病毒的结构特征及各种检测方法的应用情况进行阐述，比较各种方法的优缺点和适用性，为非洲猪瘟的诊断及防控提供参考。
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus,ASFV)引起猪的1种烈性传染病，临床上以急性、热性、出血性、高发病率和高死亡率为特征。ASFV是非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是目前已知的唯一的1个DNA虫媒病毒。ASFV于1921年在非洲肯尼亚首次被报道。1957年传入欧洲国家葡萄牙，此后的70～80年代相继在欧洲和美洲多个国家暴发。2007年传入高加索地区格鲁吉亚，8月、11月分别在亚美尼亚、俄罗斯发现ASF疫情。2012—2014年乌克兰、白俄罗斯、波兰、拉脱维亚和爱沙尼亚相继报道ASF疫情;2017年意大利、捷克和罗马尼亚暴发该病。2018年8月我国辽宁省沈阳市首次报道ASF疫情，此后河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林、天津、山西、云南、湖南和贵州等地相继暴发该病，给养猪业和国民经济造成巨大的经济损失。根据ASFV的p72基因鉴定，2018年8月在我国沈阳分离到的第1例ASFV属于p72基因Ⅱ型，与俄罗斯及东欧目前流行的格鲁吉亚毒株基因型一致，属于同一进化分支。由于目前仍缺乏安全、有效预防的疫苗，我国采取隔离、扑杀、无害化处理、消毒等措施使疫情得到有效控制。ASFV的检测对于疫情的及时处置及防控十分重要。本文就ASFV的结构特征及检测方法进行阐述，供参考。
1 ASFV结构特征
ASFV基因组为线性双链DNA分子，长度为170～193 kb，不同的毒株因基因组可变区长度不同，基因组大小存在差异。目前已知其基因组有151～167个开放阅读框，编码170多种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白。ASFV颗粒是由几个同心区域组成的二十面体形态，中心基因组形成的内核包含核仁。细胞外病毒颗粒具有外部包膜。这种包膜的重要性尚不清楚，目前的研究发现病毒感染不需要这种包膜的参与。根据编码衣壳蛋白p72的B646L基因序列的不同，AFSV至少可以分为24个基因型，根据病毒粒子不同的抗原性可将ASFV分为8个血清型。ASFV可以通过猪之间直接接触传播(如口鼻或皮肤伤口等)。感染猪的血液中有高含量的病毒，也存在于排泄物和分泌物中(如尿液、唾液、粪便等)。有的研究表明，ASFV可通过气溶胶在短距离内传播。该病毒可在肉制品中存活数周或数月，饲喂带毒的餐厨剩余物是导致家猪感染的重要途径。研究表明ASFV抗体对同源毒株具有保护作用。
2 ASFV检测技术
在ASFV尚未传入我国时，国内学者已对ASFV开展了相关研究，常华等在2006年对ASFV的VP73基因进行了克隆和表达，2007年张泉等建立了ASFV常规PCR检测方法，李维彬等建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法，为我国ASFV检测奠定了基础。目前普通PCR与实时荧光定量PCR是实验室常用的检测方法。许多新型的检测技术，如LAMP技术、交叉引物扩增法等也应用于ASFV的检测。
2.1 病原分子生物学检测
2.1.1 普通PCR技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是在模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，根据碱基互补配对原则，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“变性—退火—延伸”3步反应的多次循环，使DNA片段呈指数扩增。该技术是1985年美国学者Mullis等发明，并于1993年获得诺贝尔奖，主要应用于分子克隆、基因表达、检测等。普通PCR可对扩增反应的终点产物进行定性和半定量分析。鉴定ASFV的PCR引物一般都是根据靶向病毒基因组高度保守区域p72基因设计，具有较高特异性和敏感性，适合各类ASFV毒株的检测。
2.1.2 实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是在常规PCR技术的基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知浓度模板进行定量分析的方法。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术最大的优势就是可以实现对PCR反应中的初始模板进行定量，克服了PCR的平台效应，使定量更灵敏、更精准、更特异(可进行单个核苷酸的区分)，普通PCR可对扩增反应的终点产物进行定性和半定量分析，而实时荧光定量PCR技术可以实现对起始模板准确定量，更灵敏，是目前ASFV检测使用最多的方法。
2.1.3 环介导等温扩增技术
随着分子生物学技术的发展，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)被应用于病毒核酸的检测。此项技术是日本学者Notomi研究开发的1种恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用具有链转换特性的Bst DNA聚合酶在等温条件下恒温几十分钟，使得链转换DNA合成在不停地自我循环，完成核酸扩增反应，用肉眼就可判断结果。2008年王彩霞建立了用于ASFV的LAMP快速检测方法;James H E等也将LAMP技术应用于ASFV的检测。该检测方法针对ASFV的拓扑异构酶基因Ⅱ，其特异性已通过限制性内切酶消化反应的产物得以证实，与实时荧光定量PCR技术之间具有良好的一致性，具有简便、快速、特异性强的特点。
2.1.4 交叉引物扩增法
交叉引物扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)是使用Bst DNA聚合酶及多个引物和探针的新型等温扩增反应技术，是1种快速、灵敏且特异性高的等温扩增方法。CPA通常需要1套3～8个互补引物，这些引物可识别已鉴定的DNA中的特定基因座，并使用具有等温作用的聚合酶(如Bst、Bsm或GspSSD)，表现出很强的链置换作用。添加可结合双链反应产物的荧光染料(如SYBR GreenⅠ)，在紫外光下可观察到结合形成的荧光双链DNA产物，阳性样品呈绿色荧光，阴性样品不显示任何荧光。该方法的特点是灵敏度高，无需提取病毒DNA。
2.1.5 聚合酶交联螺旋反应
聚合酶交联螺旋反应(Polymerase cross-linking spiral reaction,PCLSR)需要使用3种特异性引物，2个外部螺旋引物，其包含与ASFVp72基因序列互补的3’序列和与外源基因互补的5’末端序列，以及ASFV特异性交联引物。Woz'niakowskiG等基于p72基因设计了1组CPA引物进行ASFV扩增，结果显示与家猪、野猪的其他病毒没有交叉反应，特异性较高。该方法已用于感染猪血液和血清中ASFV遗传物质的快速直接扩增，特异性和灵敏度高，不会与古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的cDNA发生交叉反应。使用SYBR GreenⅠ染料PCLSR可实现结果的可视化，同时使用实时PCR系统可追踪反应进程，可记录荧光曲线和溶解峰值。
2.2 病毒分离法(红细胞吸附实验)
病毒分离法是ASFV重要的病原学诊断技术，但该方法对生物安全等级、技术条件等方面要求苛刻，只能在农业农村部指定的实验室开展。ASFV可以感染猪的多种白细胞，并在其中复制，感染后的白细胞能够吸附猪红细胞，吸附后48～72 h裂解，目前还未发现猪的其他病毒具有这种特性。因此，红细胞吸附试验仍然是较敏感的ASFV检测技术。该方法的缺点是相对耗时费力。
2.3 血清学检测
2.3.1 酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，检测相应抗体或抗原的方法。该法检测ASFV抗体方法包括间接ELISA和阻断ELISA 2种，所用的包被抗原不尽相同。为提高敏感性，Cubillos C等利用p30重组蛋白(p30r)建立ELISA检测方法，用于多个地区的ASFV血清学诊断，能够准确检测ASFV抗体;仇华磊以原核表达重组VP72作为抗原建立ELISA检测方法具有很高的敏感性。ELISA检测方法敏感性高，但若样品保存不好、出现腐败变质等情况会导致敏感性降低。
2.3.2 双抗体夹心ELISA法
双抗体夹心ELISA是将特异性单克隆抗体包被聚苯乙烯微量反应96孔板，作为捕获抗体加入酶标液的待检样品如果含有ASFV抗原，则能与单克隆抗体特异性结合形成酶标复合体，洗涤净化复合物，加入底物，发生酶催显色反应，有色产物量与ASFV量相关联，从而实现对ASFV的定性或半定量检测。该方法具有快速、高通量、费用低等特点，但检测敏感性相对较低。
2.3.3直接免疫荧光试验
用荧光素标记抗ASFV特异性多抗或者单克隆抗体，然后将荧光素标记抗体与组织压片、触片以及冷冻切片上的抗原直接进行反应。直接免疫荧光抗原检测特异性、敏感性较高，但该方法对实验室的生物安全防护条件、操作技术及仪器设备要求较高，应用受到一定限制。
2.3.4 间接免疫荧光试验
将感染ASFV的原代细胞或传代细胞固定于细胞板或载玻片上，加入待检血清样品，如果被检血清中含ASFV特异性抗体，就会与细胞中的ASFV抗原结合，并与荧光素标记的二抗特异结合形成荧光复合物，显微镜下观察该复合物可做出定性或半定量判断[31]。间接免疫荧光试验对试验条件及操作要求较高。
2.3.5 免疫印迹试验
免疫印迹是1种快速、准确检测和识别蛋白质的方法。Kazakova A S等[32]制备高纯度的重组蛋白p30(ASFV内膜的一部分，是1种早期蛋白)，应用于ASFV免疫印迹诊断方法，可在感染后6～8天从家猪或野猪血清样品中检测ASFV特异性抗体。该法对实验设备、操作技术有较高的要求。
2.3.6 胶体金免疫层析法
胶体金免疫层析是将胶体金标记、免疫层析及新材料免疫等技术相结合，通过特异的抗原抗体反应对抗原进行检测。胶体金免疫层析技术具有特异性高、操作简单、快速等特点，适合基层快速初诊。如:北京森康生物技术开发有限公司生产的“非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条”用于临床快速检测，但仅限于疑似病猪、死猪ASFV的快速检测，确诊仍需实验室进一步检测。胶体金免疫层析方法除了可以应用于抗原检测，也适用于抗体的检测。2014年张鑫宇等建立了ASFV p54抗体的胶体金检测方法，该法特异性高，与猪的其他病毒抗体阳性血清无交叉反应。林彦星等研发的量子点免疫层析试纸条可快速检测ASFV抗体。胶体金免疫层析法检测假阳性率高，检测结果为阳性的应采用实验室方法进一步确诊，对于检测样品抗原或抗体浓度有一定要求，在病毒感染早期检出率低。
3 小结与展望
3.1 对于ASFV的每种检测方法都有优缺点。目前最常用的实验室检测方法为实时荧光定量PCR和普通PCR，这是世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测方法。病毒分离方法具有很高的特异性和敏感性，但是耗时较长，且有些ASFV毒株不具备吸附红细胞的能力，如果采用细胞吸附试验方法只能观察到细胞病变但未见红细胞吸附现象，应结合PCR检测结果进行判断。PCR检测特异性强、灵敏度高，但需专用设备和试剂。胶体金免疫技术快速检测不需要实验室设备，操作简便，特异性高，携带方便，肉眼可直接观察结果，但其敏感性较低，应用范围较窄，在感染早期有可能出现假阴性，只适用于疑似病猪或不明原因死亡猪的初步检测，检测结果仍然需要PCR检测结果作最终判断。LAMP有比较高的特异性和抗干扰能力，非目的片段对LAMP反应的干扰较小，反应过程简单、快速、高效，但操作过程中试管开盖容易形成气溶胶污染，对于条件较差的屠宰场检测室可能造成假阳性问题。由于目前还没有ASF疫苗接种，血清学抗体检测阳性即可判定为野毒感染，并且可用于慢性、隐性感染动物的大规模筛查，有助于该病的防控和净化。
3.2 随着科学技术的发展，许多新型的病毒检测技术不断被研发，等温扩增技术尤为突出，如LAMP、CPA、PCLSR均是核酸等温扩增技术。在保证检测结果的准确性和检测方法灵敏度的前提下，病毒的检测技术正向着简便、快速、低成本的方向发展。另外，生物传感器的研究也可用于ASFV的检测，Biagetti M设计了1种基于ASFVvp72编码基因区域的ss DNA/LNA探针，是1种无标记可重复使用的核酸生物传感器，可用于筛查猪的血液样本是否存在ASFV感染。
3.3 从ASF疫情流行的国家和地区防控工作来看，ASF的防控工作是一场持久战。一方面应加速疫苗的研制;另一方面要从提高生物安全水平措施方面着手。我国生猪屠宰企业的经营模式使得屠宰场成为病原聚集和扩散的高危区，存在很大的安全隐患。屠宰企业开展病毒的自检工作是很有必要的，也是未来的1种长久趋势和要求。为落实企业主体责任，很多地区生猪屠宰场已按要求开展ASFV自检工作。
参考文献：（略）
