云南省牛流行性出血病血清学调查

摘要：为了解牛流行性出血病（epidemic hemorrhagic disease，EHD）在云南省的流行和分布情况，采用竞争ELISA方法，2019年对11个县市的1 199 份牛血清进行流行性出血病病毒（epidemic hemorrhagic disease virus，EHDV）抗体检测，同时从各县市检测出的阳性血清中，随机选取18~50份通过微量血清中和试验进行血清型鉴定。结果显示：云南省11个县市均检测出EHDV抗体阳性样品，阳性率介于49.3%~91.3%，平均为81.8%；各地普遍存在3个及以上血清型，其中EHDV-7、-10、-6、-5血清型检出率较高，EHDV-8、-2血清型检出率较低，未检出EHDV-1型。结果表明，EHD在云南省流行广泛且较严重，流行血清型复杂。结果提示，需持续开展EHDV血清学监测，重视对该病的防控。此次血清学调查为我国西南地区EHD防控提供了数据参考。

流行性出血热（epizootic hemorrhagic disease，EHD） 是由流行性出血热病毒（epizootichemorrhagic disease virus，EHDV）引起的，通过库蠓传播的非接触性虫媒病毒病，主要引起鹿（尤其是白尾鹿）体温升高，黏膜和浆膜面广泛出血，甚至休克致死，也可引起牛发病，主要分布在热带、亚热带和温带地区。2013—2018 年，山西、内蒙古、广东、广西等地区均有检测到 EHDV 阳性血清的报道。EHD 目前尚无有效的疫苗和治疗方法，其暴发流行会给畜牧业带来巨大损失。为了解云南省 EHD 流行情况及病毒血清型分布情况，2019 年在多个县（市）采集牛血清样云南省牛流行性出血病血清学调查品进行依据。

1　材料与方法

1.1　待检样品

在云南省 5 个地州 11 个县市（芒市、瑞丽、景洪、勐腊、富宁、沾益、西盟、江城、沧源、镇康、耿马）采集牛血清样品。每个县市先按采样点所属地理位置划定采样区域，再将区域内的养殖场、活畜交易市场和散养户分别编号，然后根据场户数量，随机抽取养殖场 1~6 个、活畜交易市场个 1~2个、散养户 3~29 个进行样品采集。样品采集地优先选择年均降雨量多、年均日照时间长、相对湿度大、适于媒介昆虫库蠓生长繁殖的热带、亚热带地区。具体样品采集工作由当地县级动物疫病控制机构负责，共采集 1 199 份牛血清样品（表 1）。

表 1 2019 年云南省 11 个县市采样信息统计结果    单位 ：个 / 份

1.2　病毒

EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10 型参考病毒，由澳大利亚麦克阿瑟 ‧ 伊丽莎白农业研究所（Elizabeth Macarthur Agricultural Institute，EMAI）提供。

1.3 C-ELISA 抗体检测

按照 EHDV C-ELISA 试剂盒说明书，对待检血清进行检测。取 40 μL 稀释液加入 EHDV 抗原包被的 ELISA 板中，分别取 10 μL 被检血清样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照血清，加入到相应检测孔和对照孔中，用振荡器震荡或轻拍微量反应板；将反应板中的液体充分混匀，37 ℃温箱 温育 30 min；取出板，每孔加入 50 μL 1/100 稀释的竞争抗体，充分混匀，37 ℃温箱温育 30 min；取出板，倒掉孔中液体，在吸水纸上拍干；每孔加入 50 μL 1/100 稀释的羊抗豚鼠 HPR 酶标二抗，充分混匀，37 ℃温箱里温育 30 min；取出板，洗 板 5~6 次拍干，加入 TMB 显色液 50 μL/ 孔，37 ℃避光温育 10 min；最后加入终止液 50 μL/ 孔，用ELISA 读板仪 450 nm 波长测定样本和对照的吸光值 OD450。试剂盒质控标准：两个阳性对照孔OD450 ≤ 0.20，两孔间 OD450 差值＜ 0.05，两个阴性对照孔 OD450 ≥ 1.00 且＜ 1.60，两孔间 OD450 差值＜ 0.20。判定标准：按照抑制率（PI）=（阴性对照 OD450 平均值 - 样品血清 OD450）/ 阴性对照OD450平均值×100%。抑制率≥50%判为抗体阳性，否则为阴性。

1.4　血清型鉴定

从各地 C-ELISA 检出的阳性样品中，随机抽取 18~50 份，利用 EHDV 标准毒株进行微量血清中和试验（SNT），同时参照国家标准 GB/T18636—2017，按 Karber 方法计算 EHDV 7 个血清型标准毒株的半数感染量（TCID50），以确定阳性血清样品的血清型。

1.5　检测结果分析 采用 SPSS 22.0 软件统计各地 EHDV 抗体阳性率，分析各地 EHDV 主要流行毒株血清型。

2　结果与分析

2.1　血清抗体检测

应 用 EHDV C-ELISA 试剂盒，对云南省11 个县市 1 199 份牛血清样品进行抗体检测，检出 EHDV 抗体阳性血清 981 份，抗体阳性率 为 81.8%，各县市均检测到抗体阳性血清，表明牛 EHDV 感染在云南省普遍存在且较严重。各EHDV 抗体阳性率有所差异，其中芒市最高，阳性率达 91.3%，耿马县最低，抗体阳性率仅为49.3%。具体检测结果见表 2。

表 2 2019 年云南省牛 EHDV 血清抗体检测统计结果

2.2　场群分布

对抗体检测结果进行场群分布统计，发现养殖场阳性率较高，其次是活畜交易市场，散养户最 低，但不同采样场群抗体阳性率差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。具体结果见表 3。

表 3　不同采样场群的抗体阳性样品分布

2.3　血清型鉴定 从每个县市的血清检测阳性样品中，随机挑 选 18~50 份 与 EHDV 7 个血清型标准毒株进行 SNT 检 测。 结果（ 表 4） 显 示：EHDV-7、 -10、-6、-5 血清型检出率较高，依次为 25.2%、23.2%、22.2%、15.4%，EHDV-8、-2 血清型检出率较低，依次为 6.3%、1.8%，仅在勐腊县检测到EHDV-2 型，未检出 EHDV-1 型；各县市普遍存在 3 个及以上的 EHDV 血清型，其中勐腊县、江城县最多（6 个血清型），其次是芒市、瑞丽市、景洪市、富宁县、沾益县、沧源县、镇康县（4 个血清型），而西盟县、耿马县较少（3 个血清型）。

 表4　血清检测阳性样品中 7 个血清型的中和抗体鉴定结果

3　讨论

本研究所调查的云南省 11 个县市均位于热带或者亚热带地区，年均气温较高，降雨量较多，年均日照时间也较长，适于各类库蠓生长和繁殖，因 而有利于 EHDV 传播，说明其流行具有地域性；采集血清的牛均未注射过 EHDV 疫苗，因而血清阳性率可以反映出牛的自然感染情况；对牛血清样品进行 EHDV C-ELISA 检测发现，除耿马县（49.3%）外，其余县市抗体水平均较高，阳性率均在 69.6% 以上，说明 EHDV 在云南省流行广泛且较为严重。不同采样场群的血清样品 EHDV 抗体阳性率差异不显著（P ＞ 0.05），说明云南省不 同场点的 EHDV 流行态势相似，这可能与云南省不同场点的环境特征、传播媒介类似有关。 本研究调查了 EHDV 的 7 个血清型，结果发现各县市均存在 3 个及以上血清型的流行，其中勐腊、江城 2 个县血清型最多，有 6 个血清型。

EHDV 的流行与传播媒介库蠓的种类和移动转播 有关，从而引起新血清型传入，导致多种血清型同时存在。在血清型鉴定中发现，富宁县、西盟县、镇康县等地均存在同一份阳性血清样品检出至少 2 种血清型情况，说明云南省存在多种血清型病毒的混合流行。EHDV 血清型之间无交叉保护，这给 EHD 防治带来了困难。血清型鉴定 发现，部分血清检测阳性样品未检出上述 7 个血清型，说明云南省可能存在 7 个血清类型以外的其他血清型，也进一步说明云南省流行的 EHDV 血清型更加复杂，具体需要进一步研究。

尽管我国未见牛和鹿发生 EHD 临床病例的报道，但对牛有较强致病力的 EHDV-2、-6、-7 型毒株均分离到 [12-13]。调查发现，云南省 11 个县市中，EHDV-6、-7 血清型阳性数量较多，说明云南省有发生该病的风险，需要引起动物防疫部门和养殖户的重视。1959 年首次在日本茨城发现 EHDV-2 型 毒株导致牛发病，病死率达 10.3%，将之命名为茨城病。此次在勐腊县也检测到 EHDV-2 型，提示应加强对该地区的持续监测。

通过对云南省 11 个具有地域代表性县市的牛血清进行检测和鉴定，发现各地均存在 EHDV 多 种血清型流行，且抗体阳性率普遍较高，这需要引起疫病控制机构和养殖人员的足够重视。

      4 结论

      调查发现，EHDV 在云南省流行广泛且较严重，流行血清型复杂，需持续开展血清学监测，加强该病防控。